Vào thế kỷ 16, các cộng đồng Cossack này đã hợp nhất lại thành hai tổ chức lãnh thổ độc lập cũng như là các nhóm nhỏ hơn còn rời rạc khác.

• Người Cossack của Zaporozhia, tập trung xung quanh khúc uốn cong hạ lưu sông Dnepr, bên trong lãnh thổ Ukraina ngày nay, với thủ đô được pháo đài hóa tại Zaporozhia Sic'. Họ về mặt hình thức đã tổ chức lại thành quốc gia, là voisko Zaporozhia, bằng một hiệp ước với Ba Lan năm 1649.
• Nhà nước Cossack sông Đông, trên sông Đông, tách rời Đại công quốc Moskva ra khỏi các nhà nước Nogai khi đó là chư hầu của Đế quốc Ottoman. Thủ đô của nhà nước Cossack sông Đông là Cherkassk, sau này chuyển tới Novocherkassk.

Một số tài liệu lịch sử của giai đoạn này nhắc tới các nhà nước này như là các quốc gia độc lập có chủ quyền với nền văn hóa chiến tranh duy nhất, mà nguồn thu nhập chính của họ là từ sự cướp bóc các quốc gia láng giềng. Họ đã rất nổi tiếng vì các cuộc tấn công chống lại Đế quốc Thổ Ottoman và các chư hầu của quốc gia này, mặc dù họ không hề e ngại gì khi đi cướp bóc các quốc gia khác. Hành động của họ đã làm tăng sự căng thẳng dọc theo biên giới phía nam của Liên bang Ba Lan-Litva (Kresy), tạo ra kết quả gần như là một cuộc chiến tranh ở mức độ thấp nhưng thường xuyên trên các vùng lãnh thổ này trong gần như toàn bộ thời kỳ tồn tại của Liên bang Ba Lan-Litva.

Năm 1539, Đại công tước Vasili III của Nga đề nghị sultan Thổ kiềm chế bớt người Cossack và sultan đã trả lời:

Người Cossack không thề nguyện trung thành với tôi, và hãy để họ sống như là họ muốn.

Năm 1549, Sa hoàng Ivan Hung Đế, khi trả lời yêu cầu của sultan Thổ về việc ngăn chặn các hành động gây hấn của người Cossack sông Đông, đã nêu rõ:

Người Cossack sông Đông không phải thần dân của tôi, và việc họ thích sống trong chiến tranh hay hòa bình không phải là sự cần biết đến của tôi.

Các trao đổi tương tự đã diễn ra giữa Nga, Đế quốc Ottoman và Liên bang Ba Lan-Litva, và chúng đều thể hiện sự lợi dụng tính hiếu chiến của người Cossack cho các mục đích của chính mình. Về phía người Cossack, họ đã rất hạnh phúc khi cướp bóc mọi quốc gia này một cách công bằng nhiều hay ít, mặc dù trong thế kỷ 16, với sự thống trị của Liên bang Ba Lan-Litva được mở rộng xuống phía nam, thì người Cossack Zaporozhia đã chủ yếu được coi là thần dân của Liên bang này. Những người Cossack có đăng ký đã là một phần của quân đội Liên bang cho tới tận năm 1699.

Một người Cossack Ukraina trong thời kỳ Liên bang Ba Lan-Litva. Tranh của Dariusz T. Wielec.

Vào khoảng cuối thế kỷ 16, quan hệ giữa Liên bang Ba Lan-Litva và Đế quốc Ottoman, vốn đã không được mặn nồng cho lắm, lại càng bị làm xấu đi bởi các hành động đòi độc lập của người Cossack ngày càng gia tăng. Từ nửa sau của thế kỷ 16, người Cossack đã bắt đầu đột kích các vùng lãnh thổ dưới sự cai trị của Đế quốc Ottoman. Mặc dù là thần dân của Liên bang Ba Lan-Litva, nhưng chính quyền này cũng không thể kiểm soát những người Cossack độc lập hung tợn. Một cách tương tự, người Tatar sống dưới sự cai trị của Đế quốc Ottoman cũng tiến hành các cuộc cướp bóc vào lãnh thổ Liên bang Ba Lan-Litva, chủ yếu là vào các vùng dân cư thưa thớt ở phía đông nam liên bang này. Tuy nhiên, những kẻ cướp Cossack đã đột kích tới tận tâm của Đế quốc Thổ Nhĩ Kỳ, các hải cảng thương mại giàu có của họ, chỉ cách cửa sông Dnepr khoảng 2 ngày đi thuyền. Vào năm 1615, người Cossack thậm chí còn san bằng các thị trấn ven Constantinopolis, buộc sultan Ottoman phải chạy khỏi cung điện. Các hiệp ước nối tiếp nhau giữa Đế quốc Ottoman và Liên bang Ba Lan-Litva đều kêu gọi cả hai bên kiềm chế người Cossack và Tatar, nhưng hiệu lực của chúng gần như là không tồn tại trên cả hai bên biên giới. Trong các thỏa thuận nội bộ, được phía Ba Lan đưa ra, người Cossack đồng ý đốt thuyền của họ và ngừng cướp bóc. Tuy nhiên, thuyền có thể làm lại rất nhanh, và kiểu sống của người Cossack được tô điểm bằng cướp bóc và chiến lợi phẩm. Trong thời gian này, Đế quốc Habsburg đôi khi ngấm ngầm thuê mướn những tên cướp Cossack để làm giảm áp lực của Đế quốc Ottoman lên trên biên giới của họ. Nhiều người Cossack và Tatar đã có sự thù oán lẫn nhau do các cuộc cướp bóc từ cả hai phía gây ra. Các cuộc cướp bóc của người Cossack được nối tiếp bằng sự trả thù từ phía người Tatar hay ngược lại là chuyện xảy ra thường xuyên. Các hỗn loạn kế tiếp và chuỗi các vụ trả thù thông thường chuyển toàn bộ vùng biên giới phía đông nam của Liên bang Ba Lan-Litva thành một vùng chiến sự cường độ thấp và dẫn tới sự leo thang của cuộc chiến giữa liên bang này và Đế quốc Ottoman, từ các cuộc chiến tranh quyền quý Moldavia (1593-1617) tới trận chiến Cecora (1620-1621) và các cuộc chiến những năm 1633–1634.

"Bohdan Chmielnicki với Toğay bey tại Lvov", tranh sơn dầu, 1885, Viện bảo tàng quốc gia, Warsaw. Tranh của Jan Matejko.

Số lượng người Cossack được tăng lên cùng với những người nông dân chạy trốn khỏi thân phận nông nô trong Liên bang Ba Lan-Litva. Các cố gắng của szlachta (tầng lớp quý tộc Ba Lan-Litva) để biến người Cossack Zaporozhia thành nông nô đã xói mòn lòng trung thành của người Cossack khi đó đã tương đối mạnh đối với Liên bang. Mong muốn của người Cossack được công nhận bình đẳng với szlachta đã thường xuyên bị cự tuyệt, và các kế hoạch chuyển đổi Liên bang hai quốc gia (Ba Lan-Litva) thành ba quốc gia (với những người Cossack Ruthenia) đã có rất ít tiến bộ do thiếu sự công nhận trong toàn Liên bang. Lòng trung thành rất mạnh trong lịch sử của người Cossack đối với Chính thống giáo Đông phương tại một Liên bang mà tôn giáo chính là Công giáo Rôma đã làm tăng lên sự căng thẳng, đặc biệt khi các chính sách Liên bang thay đổi từ tương đối khoan dung sang thành ngăn cấm các nhà thờ Chính thống giáo, đã làm cho những người Cossack chống Công giáo mạnh mẽ vào thời gian này trở thành đồng nghĩa với chống Ba Lan.

Lòng trung thành đang suy giảm của người Cossack và tính kiêu ngạo của tầng lớp szlachta đối với họ đã tạo ra vài cuộc nổi dậy của người Cossack chống lại Liên bang Ba Lan-Litva vào đầu thế kỷ 17. Cuối cùng, sự từ chối cứng rắn của nhà vua trong việc nhượng bộ yêu cầu của người Cossack nhằm mở rộng sự đăng ký người Cossack đã là mẩu rơm cuối cùng thúc đẩy cuộc nổi dậy lớn nhất và thành công nhất trong số các cuộc nổi dậy: Cuộc nổi dậy Khmelnytsky bắt đầu năm 1648. Cuộc nổi dậy này trở thành một trong các chuỗi sự kiện thảm họa cho Liên bang, được biết dưới tên gọi Đại Hồng Thủy (tiếng Ba Lan: potop), dẫn đến sự tan rã của Liên bang này. Cuộc nổi dậy kết thúc vào năm 1654 với Hiệp ước Pereyaslav, trong đó người Cossack cam kết trung thành với Sa hoàng Aleksei I (1629 - 1676) cùng sự đảm bảo của Sa hoàng trong việc bảo vệ người Cossack, công nhận các starshina (quý tộc) Cossack và quyền tự trị dưới sự cai trị của ông[10], đã đưa người Cossack ra khỏi ảnh hưởng của Ba Lan. Cố gắng cuối cùng và không thành công để xây dựng lại liên minh Ba Lan-Cossack và tạo ra Liên bang Ba Lan-Litva-Ruthenia là Hiệp ước Hadiach năm 1658 đã được vua Ba Lan và Sejm cũng như một số starshina Cossack phê chuẩn, trong đó có ataman Ivan Vyhovsky. Tuy nhiên starshina đã bị chia rẽ trong vấn đề này và hiệp ước đó đã nhận được rất ít sự ủng hộ trong các tầng lớp người Cossack, vì thế đã kết thúc thất bại.